ศ. ดร. สมปอง คล้ายหนองสรวง อาจารย์ประจำภาควิชาชีวเคมี คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่นและผู้อำนวยการศูนย์วิจัยโปรตีนและโปรติโอมิกส์เพื่อการพาณิชย์และอุตสาหกรรม และคณะวิจัยได้ศึกษาค้นคว้าเกี่ยวกับโปรตีนและ เปปไทด์ที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพต่างๆ อาทิ ฤทธิ์ต้านมะเร็ง ฤทธิ์ต้านเชื้อจุลชีพก่อโรค ฤทธิ์การสมานบาดแผล และฤทธิ์ต้านอักเสบ ฯลฯ โดยมุ่งเน้นศึกษาค้นคว้าเปปไทด์ออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากจระเข้สายพันธุ์ไทย เพื่อทำความเข้าใจกระบวนการทำงานเชิงลึกของเปปไทด์ที่ค้นพบได้และนำองค์ความรู้ที่เกิดจากผลงานวิจัยนี้ในการพัฒนาต่อยอดสู่ผลิตภัณฑ์นวัตกรรม ด้านเวชสำอาง ด้านอาหารเสริมสุขภาพ รวมถึงด้านการแพทย์

สัตว์เลื้อยคลานเป็นสัตว์ที่มีอายุยืนยาวชนิดหนึ่งในอันดับและอาณาจักรของสิ่งมีชีวิต ซึ่งมีความสามารถในการดำรงชีวิตในสภาพแวดล้อมต่างๆ ได้เป็นอย่างดี แสดงให้เห็นถึงการทำงานที่ประสิทธิภาพของระบบภูมิคุ้มกันในร่างกายของสัตว์เลื้อยคลานซึ่งประกอบด้วยระบบภูมิคุ้มกันแบบสืบทอดแต่กำเนิดจากการทำงานร่วมกันของโปรตีนและเปปไทด์หลายชนิด ซึ่งมีแนวโน้มที่จะพัฒนาและประยุกต์ใช้ต้านจุลชีพ ทางด้านคลินิก อุตสาหกรรมอาหาร อุตสาหกรรมเครื่องสำอางและเวชสำอาง และการนำไปใช้ทดแทนยาปฏิชีวนะในภาวะที่มีปัญหาของเชื้อดื้อยา

จระเข้น้ำจืดสายพันธุ์ไทย (Crocodylus siamensis) มีถิ่นกำเนิดในบริเวณเวียดนาม, กัมพูชา, ลาว, ไทย, กาลีมันตัน, ชวา และสุมาตรา เป็นสายพันธุ์ที่ค่อนข้างหายากและใกล้สูญพันธุ์ไปจากเมืองไทย จระเข้น้ำจืดจะมีลักษณะของหัวทู่และสั้นกว่าจระเข้น้ำเค็ม มีเกล็ดท้ายทอย 4 เกล็ดเรียงให้เห็นชัดและเท้าหลังมีพังผืดเล็กน้อย จระเข้สายพันธุ์ไทยมีความยาวประมาณ 7-9 ฟุต (รูปที่ 1A) เมื่อโตเต็มที่หนักประมาณ 80-150 ปอนด์ วางไข่ครั้งละประมาณ 20-50 ฟอง ไข่จระเข้มีรูปทรงยาวรี (Elliptical from) มีลักษณะมนเท่าๆ กัน ไม่สามารถแยกออกได้ว่าด้านใดเป็นส่วนหัวและส่วนท้าย เปลือกไข่มีความหนาประมาณ 1 – 1.5 มิลลิเมตร (รูปที่ 1B) จากระยะออกไข่จนฟักเป็นตัว ระยะนี้จระเข้จะดุร้ายมากและเกิดการต่อสู้จนเกิดบาดแผลกันบ่อยครั้ง แต่กลับพบว่าบาดแผลของจระเข้สามารถหายได้เองในเวลาอันรวดเร็วและไม่มีการติดเชื้อ แม้ว่าจระเข้จะอาศัยอยู่ในแหล่งน้ำที่ง่ายต่อการติดเชื้อก็ตาม จึงทำให้สัตว์ประเภทนี้เป็นที่น่าจับตามองและมีนักวิจัยทำการศึกษาจนพบว่าสัตว์ในกลุ่มนี้มีระบบคุ้มกันที่มีประสิทธิภาพสูง โดยเฉพาะระบบภูมิคุ้มกันแบบสืบทอดแต่กำเนิด ซึ่งอาจมีเปปไทด์ต้านจุลชีพเป็นส่วนประกอบสำคัญ ดังรายงานผลการวิจัยจากทีมวิจัยของ ศ. ดร. สมปอง คล้ายหนองสรวง

           

รูปที่ 1 (A) จระเข้น้ำจืด (Crocodylus siamensis) อันดับ Crocodilia (Crocodilians) (B) ไข่ของจระเข้น้ำจืด (Crocodylus siamensis)

จากการศึกษาวิจัยอย่างต่อเนื่องของศูนย์วิจัยโปรตีนและโปรติโอมิกส์เพื่อการพาณิชย์และอุตสาหกรรม ทำให้ค้นพบเปปไทด์ที่มีคุณสมบัติในการเป็นสารต้านจุลชีพจากจระเข้น้ำจืดสายพันธุ์ไทย ได้แก่ เฮปซิดิน ลิวคร็อคซิน ไลโซไซม์ เฮโมโกลบิน และโอโวทรานส์เฟอริน ซึ่งสามารถสรุปภาพรวมแสดงแหล่งที่มาของเปปไทด์ต้านจุลชีพจากส่วนต่าง ๆ ของจระเข้สายพันธุ์ไทยได้ดังรูปที่ 2

รูปที่ 2 ไดอะแกรมแสดงแหล่งที่พบเปปไทด์ต้านจุลชีพจากจระเข้สายพันธุ์ไทย

จากแผนภาพจะเห็นได้ว่าโปรตีนหรือเปปไทด์หลักที่ทำหน้าที่ในการต้านเชื้อจุลชีพในไข่ของจระเข้คือโปรตีนโอโวทรานสเฟอร์ริน แทนที่จะเป็นไลโซไซม์เช่นเดียวกับไข่ของสัตว์ปีก ซึ่งโดยทั่วไปโปรตีนในกลุ่มทรานสเฟอร์รินจะมีหน้าที่ในการขนส่งเหล็กไปยังอวัยวะต่างๆ และพัฒนาตัวอ่อน แต่สำหรับโปรตีนโอโวทรานสเฟอร์รินที่พบในไข่นั้นมีโครงสร้างที่ทำให้เกิดคุณลักษณะพิเศษ โดยสามารถเกิดการตัดตัวเองได้เมื่อถูกกระตุ้นด้วยสภาวะกดดันจากภายนอก และเกิดเป็นเปปไทด์สายสั้นๆ ที่มีหน้าที่หลากหลายมากขึ้น เช่น การเป็นสารต้านอนุมูลอิสระและสารต้านจุลินชีพ แต่อย่างไรก็ตามข้อมูลต่างๆ เหล่านี้ของโปรตีนโอโวทรานสเฟอร์รินในสัตว์เลื้อยคลานยังมีอยู่จำกัด

ศ. ดร. สมปอง คล้ายหนองสรวง อาจารย์ประจำภาควิชาชีวเคมี คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น จึงสนใจศึกษาโครงสร้างของโปรตีนโอโวทรานสเฟอร์รินจากจระเข้น้ำจืดสายพันธุ์ไทย (Crocodylus siamensis) เพื่อให้เกิดความเข้าใจต่อหน้าที่และโครงสร้างของโปรตีนโอโวทรานสเฟอร์รินในสัตว์เลื้อยคลาน

ขั้นตอนการดำเนินงานวิจัยครั้งนี้เริ่มจาก ผู้วิจัยทำการแยกบริสุทธิ์โปรตีนโอโวทรานสเฟอร์รินจากไข่ขาวของไข่จระเข้โดยใช้เทคนิคทางโครมาโตกราฟฟี โดยทำการตกตะกอนโปรตีนที่ไม่ต้องการออกจากไข่ขาวของจระเข้ก่อน ซึ่งในขั้นตอนนี้สามารถตกตะกอนแยกโปรตีนโอโวบูมิลที่มีอยู่จำนวนมากออกไปได้และนำสารละลายโปรตีนที่เหลือมาแยกบริสุทธิ์ต่อด้วยคอลัมน์ที่อาศัยการแยกโดยการแลกเปลี่ยนประจุลบ และคอลัมน์ที่อาศัยหลักการแยกด้วยแรงไฮโดรโฟบิก แผนผังการแยกบริสุทธิ์แสดงดังรูปที่ 3

รูปที่ 3 กระบวนการทำบริสุทธิ์โปรตีนโอโวทรานสเฟอร์รินจากจระเข้น้ำจืดสายพันธุ์ไทย (Crocodylus siamensis)

คณะวิจัยได้ใช้เทคนิค Western blot ในการระบุชนิดของโปรตีนโอโวทรานสเฟอร์รินจากระเข้น้ำจืดสายพันธุ์ไทย ซึ่งพบว่าโปรตีนสามารถจับได้อย่างจำเพาะกับแอนตี้บอดีที่สังเคราะห์มาจากโอโวทรานสเฟอร์รินของไข่ไก่ เป็นการยืนยันผลได้ว่าโปรตีนที่ทำบริสุทธิ์ได้เป็นโอโวทรานสเฟอร์รินและมีมวลโมเลกุลอยู่ที่ประมาณ 79 กิโลดาลตัน จากการศึกษาลำดับกรดอะมิโนด้านปลายอะมิโน (N-terminus) ของโปรตีน พบว่าลำดับกรดอะมิโนเก้าตัวแรกมีความเหมือนกับลำดับกรดอะมิโนของโปรตีนโอโวทรานสเฟอร์รินที่ได้จากจระเข้แม่น้ำไนล์ ซึ่งเป็นการยืนยันผลอีกครั้งว่าโปรตีนที่แยกได้เป็นโปรตีนโอโวทรานสเฟอร์รินของจระเข้น้ำจืดสายพันธุ์ไทย

จากนั้นตรวจสอบการเป็นไกลโคโปรตีนโดยใช้เอนไซม์ PNGase F พบว่าโปรตีนโอโวทรานสเฟอร์รินของจระเข้น้ำจืดสายพันธุ์ไทยเป็นไกลโคโปรตีนที่มีสายคาร์โบไฮเดรตเชื่อมต่อแบบ N-linked นอกจากนี้ยังพบว่าโปรตีนมีหมู่ซัลไฮ-ดริลอิสระอยู่ในโมเลกุลจำนวนหนึ่งจากการทดสอบด้วยสาร DTNB

คณะวิจัยได้ตรวจสอบหน้าที่หลักของโปรตีนคือการจับกับเหล็กด้วยเทคนิคสเปกโตรสโคปีและอิเล็กตรอน พาราแมกเนติก เรโซแนนซ์ (EPR) ผลพบว่าโปรตีนโอโวทรานสเฟอร์รินของจระเข้น้ำจืดสายพันธุ์ไทยสามารถจับกับเหล็กได้สองตำแหน่ง ซึ่งคล้ายคลึงกับโปรตีนโอโวทรานสเฟอร์รินของไก่ แต่ปริมาณในการจับกับเหล็กต่ำกว่า 5 เท่า

การศึกษาการเกิดการตัดตัวเองของโปรตีนโอโวทรานสเฟอร์รินที่คาดว่าจะทำให้เกิดการทำหน้าที่อื่นๆ นอกเหนือจากการจับกับเหล็ก พบว่าโปรตีนสามารถเกิดการตัดตัวเองได้ดีที่สภาวะเป็นกรดซึ่งต่างจากโปรตีนจากไก่ที่สามารถตัดได้ดีที่สภาวะเป็นเบส นอกจากนี้คณะวิจัยได้ทำทดสอบการเป็นสารต้านอนุมูลอิสระของเปบไทด์ดังกล่าวพบว่าเปปไทด์โปรตีนที่ได้สามารถยับยั้งสารอนุมูลอิสระได้ดีกว่าตัวโปรตีนที่ไม่ได้เกิดการตัดตัวเองถึงสองเท่าเช่นเดียวกันกับโปรตีนโอโวทรานสเฟอร์รินของไก่แม้ว่าสภาวะที่เกิดการตัดจะแตกต่างกัน

เพื่อให้เกิดความเข้าใจของโครงสร้างต่อหน้าที่ของโปรตีน คณะวิจัยจึงทำการโคลนนิ่งโปรตีนโอโวทรานเฟอร์รินของจระเข้น้ำจืดสายพันธุ์ไทยโดยเทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) พบว่ายีนของโปรตีนนี้มีขนาด 2040 เบส และแปลงเป็นกรดอะมิโนได้ 679 ตัว เมื่อชักนำการแสดงออกในระบบโปรคาริโอติก และแยกบริสุทธิ์โดยใช้เทคนิคโครมาโท กราฟีแบบแยกตามความจำเพาะ ทำการยืนยันผลโปรตีนด้วยเทคนิค Western blot และพบว่าโปรตีนมีมวลโมเลกุลอยู่ที่ประมาณ 76 กิโลดาลตัน ซึ่งน้อยกว่าโปรตีนจากไข่เนื่องจากไม่มีการเติมสายไกลเคนในโมเลกุล และผลจาก LC/MS-MS ยืนยันผลได้ชัดเจนว่าโปรตีนที่แยกได้คือโปรตีนโอโวทรานเฟอร์ริน

เมื่อตรวจสอบความสามารถในการทำหน้าที่ของรีคอมบิแนนท์โปรตีน (โปรตีนที่ได้จากการโคลนนิ่ง) โดยการทดสอบการจับกับเหล็กพบว่ารีคอมบิแนนท์โปรตีนสามารถจับกับเหล็กได้แม้ว่าจะไม่มีสายไกลเคนในโมเลกุล แต่จับกับเหล็กได้ในปริมาณที่ต่ำกว่าโปรตีนที่มาจากไข่ นอกจากนี้ยังสามารถเกิดการตัดตัวเองเป็นเปปไทด์และแสดงคุณสมบัติในการเป็นสารต้านอนุมูลอิสระได้เช่นเดียวกับโปรตีนโอโวทรานสเฟอร์รินที่มาจากไข่ไก่ ซึ่งโปรตีนโอโวทรานสเฟอร์รินจากจระเข้อาจจะเป็นอีกทางเลือกหนึ่งในการนำไปใช้เป็นสารต้านอนุมูลอิสระในสภาวะที่ตรงข้ามกับโปรตีนโอโวทรานสเฟอร์รินที่มาจากไก่

คณะวิจัยมีวัตถุประสงค์ที่จะศึกษาโครงสร้างของโปรตีนโอโวทรานเฟอร์รินของจระเข้น้ำจืดสายพันธุ์ไทยเพื่อให้เกิดความเข้าใจต่อหน้าที่และโครงสร้างของโปรตีนมากขึ้น โดยได้ศึกษาโครงสร้างทุติยภูมิด้วยเทคนิค Circular Dichroism Spectroscopy พบว่าโปรตีนประกอบไปด้วยโครงสร้างหลักที่เป็นสายแอลฟ่าฮีลิกและเบต้าชีท การศึกษาโครงสร้างตติยภูมิทำได้โดยใช้เทคนิคการจำลองโมเลกุลโดยใช้โปรตีนโอโวทรานสเฟอร์รินจากไก่เป็นต้นแบบ ในการจำลองนั้น ผู้วิจัยได้ทำการจำลองโครงสร้างในสองรูปแบบคือในรูปแบบของโปรตีนที่ไม่จับกับเหล็กและโปรตีนที่จับกับเหล็ก โครงสร้างของโปรตีนจากสัตว์ทั้งสองชนิดจะมีความคล้ายคลึงกัน (รูปที่ 4A) มีจำนวนของกรดอะมิโนซีสเตอิน (Cys) ที่เท่ากัน แต่มีพันธะไดซัลไฟด์ที่ต่างกัน แสดงในรูปที่ 4B ส่วนตำแหน่งในการจับกับเหล็กของโปรตีนเป็นกรดอะมิโนอนุรักษ์ 4 ตัวในแต่ละ lobe คือ Asp63, Tyr95, Tyr190, His249 ใน N-lobe และAsp389, Tyr426, Tyr517, His585 ใน C-lobe (รูปที่ 4C) ซึ่งเป็นการยืนยันว่าโปรตีนนี้สามารถจับกับเหล็กได้

จำนวนพันธะไดซัลไฟด์ของโปรตีนโอโวทรานเฟอร์รินจากจระเข้น้ำจืดสายพันธุ์ไทยจะมีเพียง 13 พันธะ และมีหมู่ซัลไฮดริลอิสระอยู่ในโมเลกุล 4 ตัว ผู้วิจัยพบว่าการขาดหายไปของพันธะไดซัลไฟด์ระหว่างโดเมนของโปรตีนที่ตำแหน่งของ Cys472-Cys664 (รูปที่ 4B) รวมถึงการหายไปของพันธะไฮโดรเจนระหว่างอะตอม Arg534 และ Lys631 (รูปที่ 4D) ใกล้กับบริเวณของการจับกับเหล็กอาจจะส่งผลให้เกิดการจับกับเหล็กได้น้อยลง ในทำนองเดียวกันกับบริเวณที่จะเกิดการตัดตัวเองของโปรตีนพบว่ามีพันธะไดซัลไฟด์ตำแหน่ง Cys174-Cys181 ขาดหายไป (รูปที่ 4B) และการมีหมู่ซัลไฮดริลอิสระอยู่อาจทำให้เกิดการตัดตัวเองได้ที่สภาวะเป็นกรดได้ เนื่องจากโครงสร้างของโปรตีนที่ไม่เสถียรและเกิดปฏิกิริยารีดอกซ์ได้ง่าย

จากการศึกษาของทีมวิจัยในศูนย์วิจัยโปรตีนและโปรติโอมิกส์เพื่อการพาณิชย์และอุตสาหกรรม พบว่ารูปแบบการแสดงออกของโปรตีนในไข่ขาวของจระเข้มีความคล้ายคลึงกับโปรตีนในไข่ไก่มากที่สุด แต่จุดที่น่าสนใจพบว่าในไข่ขาวของไข่ไก่มีโปรตีนหลักคือโอวัลบูมิน และมีโปรตีนไลโซไซม์ทำหน้าที่ในการเป็นสารต้านจุลชีพ ในขณะที่ไข่ขาวของกลุ่มสัตว์เลื้อยคลานมีโปรตีนหลักคือ โอโวทรานส์เฟอริน และไม่พบโปรตีนกลุ่มไลโซไซม์ในไข่ ซึ่งอาจเป็นไปได้ว่าโปรตีนที่มีบทบาทสำคัญในการทำหน้าที่ขนส่งเหล็ก ต้านอนุมูลอิสระและต้านเชื้อจุลินชีพในไข่ของสัตว์เลื้อยคลาน อาจเป็นโปรตีนโอโวทรานสเฟอร์รินที่ทำหน้าที่หลัก จากงานวิจัยดังกล่าวจะเป็นประโยชน์ต่อการพัฒนาทางการแพทย์และเภสัชวิทยาในอนาคตต่อไป

รูปที่ 4 A) โครงสร้างสามมิติของโปรตีนโอโวทรานเฟอร์รินจากจระเข้น้ำจืดสายพันธุ์ไทย N-lobe (สีเขียว) และC-lobe (สีชมพูส้ม) เปรียบเทียบกับโครงสร้างจากไก่ (สีเหลือง) B) แสดงพันธะไดซัลไฟด์ของโปรตีนโอโวทรานเฟอร์ริน C) และ D) แสดงบริเวณของการจับกับเหล็ก

 

คณะวิจัยโครงการฯ

• ดร. สุกัญญา ไชยป่ายาง (ภาควิชาชีวเคมี คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น, สถาบันวิจัยแสงซินโครตรอน)
• ดร. ชมภูนุช ส่งสิริฤทธิกุล (สถาบันวิจัยแสงซินโครตรอน)
• Prof. Dr. Chun-Jung Chen (Scientific Research Division, National Synchrotron Radiation Research Center, Hsinchu, Taiwan)
• Dr. Philip M. Palacios และ Dr. Brad S. Pierce (Department of Chemistry and Biochemistry, University of Texas at Arlington, Texas, USA)
• ดร. นิศาชล แจ้งพรมมา และ ศ. ดร. สมปอง คล้ายหนองสรวง (ภาควิชาชีวเคมี คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น, ศูนย์วิจัยโปรตีนและโปรติโอมิกส์เพื่อการพาณิชย์และอุตสาหกรรม)

เอกสารอ้างอิง

1. Merchant M.E., Roche C.M., Thibodeaux D., Elsey R.M. (2005) Identification of alternative pathway serum complement activity in the blood of the American alligator (Alligator mississippiensis). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 141(3):281-288.
2. Chaipayang, S., Heamatorn, N., Keha, L., Daduang, S., Songsiriritthigul, C. Swatsitang, P., Dhiravisit, A. & Thammasirirak S. (2013). Purification and characterization of Ovotransferrin from Crocodylus siamensis. The Protein Journal. 32: 89-96. DOI 10.1007/s10930-012-9461-2.
3. Chaipayang, S., Songsiriritthigul, C., Chen, C-J., Palacios, P. M., Pierce, B. S., Jangpromma, N. & Klaynongsruang S. (2017). Purification, characterization, cloning and structural analysis of Crocodylus siamensis ovotransferrin for insight into functions of iron binding and autocleavage. Comparative Biochemistry and Physiology (CBP) Part B: Biochemistry & Molecular Biology. 212, 59–69.
4. สมปอง คล้ายหนองสรวง, (2558). เปปไทด์ต้านจุลชีพในสัตว์เลื้อยคลาน. กรุงเทพฯ: บริษัทอมรินทร์พริ้นติ้งแอนด์พับลิชชิ่ง