รศ. ทนพญ. ดร. จารุวรรณ ศิริเทพทวี อาจารย์ประจำภาควิชาเคมี สำนักวิชาวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีสุรนารี ได้ค้นพบโปรตีน EuP-82 ซึ่งเป็นเซอรีนโปรตีเอสชนิดใหม่ โดยสกัดได้จากน้ำยางของต้น Euphorbia cf. lactea ซึ่งเป็นพืชในกลุ่มเดียวกันกับต้นสลัดไดที่พบได้ในประเทศไทย คณะวิจัยพบว่าเซอรีนโปรตีเอส EuP-82 มีคุณสมบัติสลายลิ่มเลือดของมนุษย์ ซึ่งมีแนวโน้มการนำไปใช้ประโยชน์ทางการแพทย์

ดร. จารุวรรณ ศิริเทพทวี ได้ทำบริสุทธิ์เซอรีนโปรตีเอสดังกล่าวและศึกษาคุณลักษณะของเอนไซม์ พบว่าเอนไซม์สามารถย่อยทุกหน่วยย่อยของไฟบริโนเจนของมนุษย์ จากการศึกษาลำดับกรดอะมิโนด้านปลายอะมิโน (N-terminus) ของเอนไซม์และทำ Peptide Mass Fingerprint ยืนยันได้ว่า EuP-82 เป็นเซอรีนโปรตีเอสชนิดใหม่

 

รูปที่ 1 ต้น Euphorbia cf. lactea ซึ่งนำมาสกัดน้ำยางและทำบริสุทธิ์โปรตีนเซอรีนโปรตีเอสในงานวิจัยนี้

                       

ผลของการศึกษาการจับกันของ EuP-82 และไฟบริโนเจนของมนุษย์ด้วยเทคนิค Isothermal Titration Calorimetry (ITC) การเกาะกลุ่มของเกล็ดเลือดและการย่อยก้อนไฟบริน พบว่า เซอรีนโปรตีเอสชนิดนี้ สามารถจับกับไฟปริโนเจนได้หลายตำแหน่ง ซึ่งแตกต่างจากพลาสมินของมนุษย์ นอกจากนี้ยังพบว่าเอนไซม์ EuP-82 ไม่มีคุณสมบัติของทรอมบินและกระตุ้นการแข็งตัวของเลือด ซึ่งแสดงให้เห็นว่า เอนไซม์ EuP-82 เข้าจับกับไฟบริโนเจนคนละตำแหน่งกับทรอมบิน ผลการทดลองจากเทคนิค Synchrotron Radiation-Based Fourier Transform Infrared (SR-FTIR) Microspectroscopy ที่ระบบลำเลียงแสงของสถาบันวิจัยแสงซินโครตรอน เพื่อพิสูจน์หมู่ฟังก์ชันของโมเลกุลคาร์โบไฮเดรต พบว่าเซอรีนโปรตีเอสที่ค้นพบใหม่จากต้น Euphorbia cf. lactea เป็นไกลโคโปรตีนและเมื่อกำจัดส่วนไกลแคนออก เอนไซม์ดังกล่าวยังคงมีคุณสมบัติในการเป็นโปรตีเอส

 

ในการวิเคราะห์โครงสร้างสามมิติของเอนไซม์ ด้วยเทคนิค Macromolecular X-ray Crystallography คณะวิจัยได้เตรียมผลึกของโปรตีนเซอรีนโปรตีเอสในสารละลายที่ประกอบด้วยโซเดียมอะซีเตท บัฟเฟอร์ทริส และโพลีเอธิลีนไกลคอล 4,000 ในอัตราส่วนความเข้มข้นที่เหมาะสม ที่อุณหภูมิบ่ม 18 องศาเซลเซียส เป็นเวลาสามสัปดาห์ ด้วยเทคนิค Microbatch (รูปที่ 2A; ผลึกของโปรตีนเซอรีนโปรตีเอสขนาดประมาณ 25 × 25 × 5 ลูกบาศก์ไมโครเมตร) ซึ่งสามารถเก็บข้อมูลการเลี้ยวเบนรังสีเอกซ์ได้ความละเอียดระดับ 6.77 อังสตรอม (รูปที่ 2B) มี unit-cell parameters a = 230.11, b = 1136.89, c = 115.07 Å จัดอยู่ในกลุ่มสมมาตรแบบ Orthorhombic และมี space group แบบ C222

รูปที่ 2 2A) ผลึกของโปรตีนเซอรีนโปรตีเอส 2B) แบบแผนการเลี้ยวเบนรังสีเอกซ์จากผลึกของโปรตีนเซอรีนโปรตีเอส

ผลจากการเตรียมผลึกเดี่ยวและการเลี้ยวเบนรังสีเอกซ์แสดงให้เห็นว่า EuP-82 เป็นไกลโคโปรตีนที่มีความเป็นเนื้อเดียวกัน คณะวิจัยได้ทดสอบและสรุปว่า EuP-82 ไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์ที่มีชีวิต (NIH-3T3) และจากผลการทดลองทั้งหมดในงานนี้สนับสนุนข้อมูลว่าโปรตีน EuP-82 มีฤทธิ์สลายลิ่มเลือดของมนุษย์

คณะวิจัยวางแผนที่จะศึกษาโครงสร้างโปรตีนด้วยเทคนิค Multiple Isomorphous Replacement (MIR) เพื่อหาเฟสเริ่มต้นของโครงสร้างโปรตีน เพื่อนำไปสู่ความเข้าใจคุณสมบัติของโปรตีนเพื่อปรับปรุงพัฒนาให้มีคุณสมบัติที่ดีซึ่งจะเป็นประโยชน์และเหมาะสมกับการประยุกต์ใช้ต่อไป

คณะวิจัยโครงการฯ

• รศ.ทนพญ. ดร. จารุวรรณ ศิริเทพทวี, ผศ. ดร. พิทักษ์ ชุติมา ตลับนิล (ภาควิชาเคมี สำนักวิชาวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีสุรนารี)
• ดร. จารุณี วานิชธนันกูล (ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ)
• ดร. ชมภูนุช ส่งสิริฤทธิกุล และ ดร. กาญจนา ธรรมนู (สถาบันวิจัยแสงซินโครตรอน)
• Prof. Dr. Chun-Jung Chen (Scientific Research Division, National Synchrotron Radiation Research Center, Hsinchu, Taiwan)
• รศ.ดร. นันทรัตน์ โฆมานะสิน (คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น)

เอกสารอ้างอิง

1. Siritapetawee, J., Sojikul, P. & Klaynongsruang, S (2015). Biochemical characterization of a new glycosylated protease from Euphorbia cf. lactea latex.  Plant Physiology and Biochemistry. 92, 30-38. DOI: 10.1016/j.plaphy.2015.04.012.
2. Siritapetawee, J., Limphirat, W., Kantachot, C. & Kongmark, C. (2015) The effects of metal ions in Euphorbia cf. lactea latex on the fibrinogenolytic activity of a plant protease. Applied Biochemistry and Biotechnology. 175, 232–242.
3. Siritapetawee, J., Talabnin, C., Vanichtanankul, J., Songsiriritthigul, C., Thumanu, K., Chen, C-J. & Komanasin, N. (2017). Characterization of the binding of a glycosylated serine protease from Euphorbia cf. lactea latex to human fibrinogen. Biotechnology and Apply Biochemistry. 64(6), 862-870.